Incubatie oven
Nu het weefsel gefixeerd is kan het opgeslagen en geïndexeerd worden in afwachting van verdere bewerking.
De volgende stap is het uitspoelen van het fixatief in een geselecteerd stukje weefsel. Voor paraffine preparaten zijn de stukjes weefsel gefixeerd in picrinezuur het meest geschikt. Na het uitspoelen met gewoon kraanwater wordt het weefsel in een histocassette geplaatst en in een stijgende alcoholreeks ontwaterd. (50%-70%-85%-96%-100%).
Dit duurt enige dagen, daarna gaat het weefsel in een intermedium (een potje met 50% paraffine en 50% xyleen) in een incubatieoventje (58ºC).
Na een dag gaat het weefsel in een potje met 100% paraffine het oventje in en uiteindelijk is het weefsel verzadigd met paraffine en kan het weefsel in een blok gegoten worden.
De opengemaakte cassette wordt gebruikt als de basis waarop het blokje weefsel wordt geplakt.
Nu kan het weefsel worden gesneden op een rotatiemicrotoom.
Het weefsel wordt op een standaard dikte van 4 micron (mµ) gesneden. (een mµ is 1/1000mm, een menselijke hoofdhaar is gemiddeld 100 mµ dik)
Paraffine blokken maken
Leitz 1512 Rotatiemicrotoom
De plakjes worden met een penseel opgepakt en in een warm strekbad met gedemineraliseerd water gelegd. Na enige tijd worden de 4 micron dikke drijvende plakjes opgeschept met een schoon objectglaasje en op een warmteplaat te drogen gelegd.
Nu dient de paraffine in het weefsel weer verwijderd te worden. Het weefsel gaat eerst in een xyleenbad, en daarna in een afnemende reeks alcoholen (100%-96%-85%-70%-50%). Hierna volgt het kleuren van het weefsel. Vervolgens wordt een druppeltje UV-insluitmiddel aangebracht, voorzien van een dekglaasje en uitgehard met een UV lamp.
Er zijn bijzonder veel kleuringen mogelijk, vaak zeer complex. Met histochemische kleuringen kunnen specifieke celtypes aangekleurd worden.
De standaard kleuring in de histologie is de Hematoxyline-Eosine kleuring (HE kleuring).
Dit is een tamelijk eenvoudige snel uit te voeren kleuring.
Hieronder een kleine selectie van de meest gebruikte kleuringen.
Strekbad en warmteplaat
De algemene standaard kleuring
waarbij de basische kleurstof hematoxyline de basofiele structuren blauwpaars kleurt en de eosine de eosinofiele structuren helder roze kleurt.
Een gemodificeerde snelle versie van de orginele AZAN kleuring, met veel kleurdifferentiatie. De orginele azankleuring duurt enige uren. Dit is een klassieke overzichtskleuring.
Een typische bindweefselkleuring waarbij collageen selectief rood wordt gekleurd met een bruin-gele tegenkleuring met Weichert's ijzerhematoxyline.
Een histochemische kleuring waarbij suikergroepen zoals slijmbekercellen selectief rood worden aangekleurd met een blauwe tegenkleuring met hematoxyline.
Bloedkleuring, erytrocyten kleuren roze, trombocyten kleuren lichtroze, het cytoplasma van lymfocyten kleurt helder blauw, monocyt cytoplasma kleurt lichtblauw en het nucleaire chromatine van leukocyten kleurt magenta.
De standaardkleuring voor weefsel, ingesloten in kunststof. Een metachromatische kleuring met veel weefsel differentiatie. Met deze kleurstof is een tegenkleuring niet nodig.
Een veilige standaardkleuring voor fluorescentiemicroscopie. Deze stof kleurt typisch DNA en RNA zodat DNA een groene kleur en RNA een rode kleur afgeeft. Ook zeer geschikt voor botanische kleuringen.
DAPI is een kleurstof voor fluorescentiemicroscopie die vooral aan chromatine bindt. DAPI zendt een cyaanblauw licht uit. Hiermee kan eenvoudig DNA aangetoond worden. Dapi is echter carcinogeen en mutageen en dient voorzichtig behandeld te worden.
Mallory's trichroom kleuring is eveneens een fraaie overzichtskleuring en maakt gebruik van drie kleurstoffen, anilineblauw , zure fuchsine en oranje G met veel kleurdifferentiatie.